祁庆生教授：基于CRISPR-Cas9一步式改造细菌基因组

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11月24日，在《Scientific Reports》发表的一项研究中，山东大学生命科学学院的祁庆生教授带领的研究小组，描述了一个CRISPR-Cas9辅助的非同源末端连接（CA-NHEJ）策略，用于细菌基因高效而快速的失活——以一种不依赖同源重组的方式，并无需无选择标记的使用。

同源重组介导的基因工程，已广泛应用于原核生物中，并具有较高的效率和准确性。然而，用这种方法来实现更大规模的基因组编辑（具有许多基因或大的DNA片段），还是有限的，因为DNA编辑模板构建的程序相对复杂。山东大学生命科学学院的祁庆生教授带领的研究小组，描述了一个CRISPR-Cas9辅助的非同源末端连接（CA-NHEJ）策略，用于细菌基因高效而快速的失活——以一种不依赖同源重组的方式，并无需无选择标记的使用。

祁庆生教授早年毕业于山东大学，2001年在德国明斯特大学微生物系获博士学位。2001年被聘为德国开姆尼茨工业大学生物工程系课题组负责人。2004年回国任山东大学微生物技术国家重点实验室教授，博士生导师。主要研究方向为：微生物合成与代谢调控。

CRISPRs和CRISPR相关蛋白（Cas）蛋白的新应用，已经彻底改变了基因组工程。在单引导性RNA（sgRNA）的指导下，CRISPR-Cas9系统可在任何基因组位点上产生双链断裂（DSBs）。这些DSBs可以由HR或通过非同源末端连接（NHEJ）修复。在高等生物中，相比较HR而言，NHEJ是主要的DNA修复系统，来维持基因组的稳定性。NHEJ完全适合于管理DSBs，因为这条路径没有显示出对DNA末端结扎的序列要求。

然而，由于断裂的DNA末端经常损坏，并需要进行修改，NHEJ修复机制往往容易在结合位点产生插入或缺失（indel）突变。因此，在可编程的CRISPR-Cas9 DNA切割系统的帮助下，NHEJ能产生移码突变，破坏靶基因，而无需使用同源修复供体。而在原核生物中，这一强大的DNA修复机制并不普遍，由于它们普遍缺乏NHEJ途径，Cas9产生的DSB对大多数微生物是致命的。最近的研究表明，参与真核生物NHEJ的关键因素——Ku70/Ku80二聚体和DNA连接酶IV，在原核生物中存在功能性的同系物。细菌的Ku蛋白在尺寸上比它们的真核生物相对物小得多，但却通过在断端形成环形的同型二聚体结构，而保护受损的DNA。

在某些物种中，如结核分枝杆菌和芽孢杆菌，保守的原核NHEJ途径可保护细菌基因组免于意想不到的DSBs，并促进遗传变异。该系统也可以被利用来开发一种细菌基因组工程方法，比依赖于HR的基因组工程方法更简单，其中选择性标记和供体DNA模板是不必要的。

在这项研究中，研究人员描述了一个CRISPR-Cas9辅助的非同源末端连接（CA-NHEJ）策略，用于细菌基因高效而快速的失活——以一种不依赖同源重组的方式，并无需无选择标记的使用。该研究表明，CA-NHEJ可以用来一步式地删除大的染色体DNA片段，而无需同源DNA模板。因此，它是一种新的和功能强大的工具，用于细菌基因组编辑，并具有加速基因组进化的潜力。

cao1976

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