医学真菌检验技术

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  医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，随着真菌感染病例的日益增多，对实验室的诊断也提出了更高的要求。不论是患者浅部或深部感染诊断，几乎全依赖于临床标本的真菌学检查。特别是系统性真菌感染，其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键，而病原真菌的形态结构十分多样，在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态。因此，在真菌的实验室检查中，必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律，才能获得对致病真菌正确的诊断。目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类。常规检查法主要包括：①形态学检查(直接镜检+染色镜检)。②培养检查。③组织病理学检查。特殊检查主要包括：①血清学方法。②分子生物学方法。

       一、进行真菌实验室诊断的注意事项
  
       ①应有独立实验室，不应与其他细菌、病毒等实验室共用，以防发生相互污染。②在每天工作前与工作后，工作台均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%过氧乙酸 擦拭，如遇操作台被真菌或标本污染，应即覆盖纸巾，并用5%石碳酸消毒20min，切忌工作台污染后即用水冲洗，以免污染扩散。③培养菌检体及真菌污染的 物质在丢弃前，必须高压灭菌或焚烧。④在进行真菌检查时，不可试着闻平板培养基特殊的气味。⑤不可对Histoplasma capsulatum 以及 Coccidioides immitis进行载玻片培养技术，因为其等具有高度感染性的孢子能够随着空气传播。⑥实验室禁止任意养花、草、动物等生物，以防实验污染。⑦工作环境应 定期消毒。一般紫外线照射不能杀灭真菌，应用40%甲醛(可于每4㎡空间用35ml 40%甲醛加18g高锰酸钾在密闭情况下熏蒸24h，或用环氧乙烷进行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培养基接种标本，必须将平板培养基密封，以免发生危险，在不常做真菌检测的实验室，最安全的培养方法是利用含有棉花塞的试管培养基(使空气能够循环)。⑨美国梅育诊所主张利用平板培养基进行真菌的分离，步骤如下：平板培养基必须在生物安全箱内操作及检查。平板培养必须用胶带封好，平板培养基必须含30ml的量，并保持培养箱60%以上的湿度，同时增加琼脂的浓度至2%，以免脱水。⑩真菌的诊断，需要经验的累积及备有良好的图谱参考书。

       二、分离及鉴定真菌的培养基

       (一)配制培养基的一般原则

       ①各成分混匀后以文火缓慢加热，并不断搅拌，煮沸1min，过热会破坏有效成分。②分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后。③高压灭菌一般在118～121磅，10～15min。④需加血液或不能高压的成分如抗生素，应在培养基冷却至50左右时加入混匀。⑤试管分装量约7~8ml，平皿约15ml，如需培养4～6周，平皿内应有35～40ml的量。培养基中抗生素的浓度和添加方法：氯霉素、庆大霉素和放线菌酮能耐热，可在培养基高压灭菌前加入，其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入。青霉素20～100μg/ml，链霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放线菌酮500μg/ml，庆大霉素5μg/ml。

       (二)分离和鉴定真菌的培养基

       各种医学真菌所用培养基的成分，又可根据不同要求，分成分离、富集、选择、特性研究等含不同成分培养基，具体见表。

       表 分离鉴定真菌培养基分类表

       培养基种类 分离用培养基  

       使用目的

       1.Brain heart infusion agar 分离腐生性及病原性真菌
       2.Brain heart infusion agar with antibiotics 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
       3.Brain heart infusion biphasic blood Culture bottles 从血液中分离真菌
       4.Dermatophyte test medium 分离皮肤丝状菌，建议仅做筛检用
       5.Inhibitory mold agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
       6.Mycosel or mycobiotic agar 分离皮肤丝状菌
       7.Ssbouraud dextrose agar 分离腐生性及病原性真菌
       8.Yeast estract phosphate agar 分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌

       区分试验培养基  

       1.Ascospore agar 检测产子囊孢子酵母菌
       2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue 检测产厚膜孢子酵母菌
       3.Cottonseed conversion agar 使双相型真菌由霉菌型转变为酵母型
       4.Czapek’s agar 分离及区分Aspergillus spp
       5.Niger seed agar 鉴定Cryptococcus neoformans
       6.Nitrate reduction medium 检测Cryptococcus spp.还原nitrate能力
       7.Potato dextrose agar 证实Trichophyton rubrumm 产色素能力制作载玻片培养技术
       8.Yeast fermentation broth 测定酵母菌的发酵能力
       9.Yeast nitrogen base agar 测定酵母菌的糖类同化能力
三、临床样本的采集与处理

       (一)皮屑 边缘、疱壁、脓液、深层趾(指)间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同时种于沙氏琼脂加氯霉素2管，置25℃培养2周。

       (二)甲屑 用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后种于沙氏(SDA)培养4周，并同时作KOH涂片。

       (三)毛发 取病发(变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除)15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检，5～10根种于沙氏琼脂(加氯霉素)，划破斜面掩埋。

       (四)脓液 无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作G染色或抗酸染色，常规的KOH涂片及SDA接种培养也是必要的。

       (五)CSF 采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养(SDA)25℃或37℃4周。

       (六)血液 无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA(注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。

       (七)体液、痰液、尿液、粪便①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养(SDA每管种0.5ml)。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来；C.容易干竭。采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养(加抗生素)注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。

       (八)组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm3的小块，KOH涂片培养。

       四、真菌学检验的基本技术

       (一)直接镜检

       是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液：A.10%~20%的KOH。配方：氢氧 化钾10～20g，蒸馏水加至100ml，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。B.复方氢氧化钾溶液配方：氢氧化钾(AR)10g，二甲基亚砜(AR)40ml，甘油50ml, 蒸馏水加至100ml,配制方法：将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后，再依次加入DMSO、甘油揺匀后，用蒸馏水加到100ml，装入塑料瓶内。此配方的优点是：配方中加DMSO，能促进角质的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，氢氧化钾的浓度相对低，腐蚀性亦低，为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。②胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。③涂片染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择适当的染色方法，染色后，以高倍镜或油镜观察。

       常见镜检染色方法有：①革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。②乳酸 酚棉蓝染色：用于各种真菌培养物的镜检。③印度墨汁：用于检测脑脊液(CSF)中的新生隐球菌。④抗酸染色：用于抗酸菌及诺卡菌的诊断。⑤瑞氏染色：用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。⑥过碘酸锡夫染色(PAS)：用于体液渗出液和组织匀浆等。真菌胞壁中的多糖染色后呈红色，细菌和中性细胞偶可呈假阳性，但与真菌结构不同，不难区别。⑦嗜银染色(GMS)：真菌可染成黑色，主要用于测定组织内真菌。
       (二) 真菌培养

       从临床标本中对致病真菌进行培养，目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥补直接镜检的不足，同时确定致病菌的种类。真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外，还应准备真菌专用的接种针、接种环、或接种钩(用铂丝或镍丝制成)、微型小铲、刀片、针头等，常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养基，加0.05%氯霉素，还有多种性质的培养基(见第二部分)以满足各种不同的需要，可酌情选用接种的方法，根据不同的临床标本，大体可分为点植法和划线法两种。①点植法：适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本，将标本直接与培养基表面点状接触。②划线法：适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本，用接种针(环)划线接种在培养基表面。

       培养方法有多种，接临床标本接种时间分为直接培养法和间接培养法；按培养方法分为试管法、平皿法(大培养)和玻片法(小培养)。①直接培养：采集标本后直 接接种于培养基上。②间接培养：采集标本后，暂保存，以后集中接种。③试管培养：是临床上最常用的培养方法之一，培养基置于试管中，主要用于临床标本分离 的初代培养和菌种保存。④大培养：将培养物接种在培养皿或特别的培养瓶内，主要用于纯菌种的培养和研究。⑤小培养：主要用于菌种鉴定，大致分为三种：玻片 法，方块法和钢圈法。A.玻片法：在消毒的载玻片上，均匀地浇上熔化的培养基，不宜太厚。凝固后接种待鉴定菌株，置于平皿中，保湿。待有生长后，盖上消毒 的盖玻片，显微镜下直接观察，常用米粉吐温琼脂培养基观察白念珠菌的顶端厚壁孢子和假菌丝。B.方块法：适用于霉菌菌落的培养。取无菌平皿倒入约15ml 熔化的培养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm2大小的小块。取一小块移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻 片，放入无菌平皿中的V形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸馏水，孵育，待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察。C.钢圈法：先将固体石蜡加 热熔化，取直径约2cm，厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈，火焰消毒后趁热浸入石蜡油，旋即取出冷却，石蜡油即附着于小钢圈中。再取一无菌载玻片， 火焰上稍加热，将小钢圈平置其上，孔口向上。小钢圈上石蜡油遇载玻片的热即熔化后凝固，钢圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基，培 养基量约占小钢圈容量的1/2，注意避免气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰上加热后，趁热盖在小钢圈表面，也即固定其上。最后用接种针伸入孔口进 行接种。这种方法的优点是形成一种封闭式培养，在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子吸入人体，而且不易被污染，盖玻片也可取下染色后封固制片保存。

       (三)培养检查

       标本接种后，每周至少检查2次，观察以下指标：①菌落外观：A.生长速度：缓慢生长菌：7～14d，快速生长菌：2～7d。一般浅部真菌超过2周深部真菌超过4周仍无生长，可报告阴性。B.外观：a.扁平。b.疣状。c.折叠规则或不规则。d.缠结或垫状。e.其他。C.大小：菌落大小用cm来表示，菌落大小与生长速度和培养时间有关。D.质地：a.平滑状。b.粉状。c.粒状。d.棉花状。e.粗毛状。f.皮革状。g.粘液状。h.膜状。E.顔色：不同的菌种表现出不同的顔色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的顔色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也可变色，如马尔尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有顔色，其背面也有深浅不同的顔色。菌落的顔色与培养基的种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素有关。所以，菌落的顔色虽在菌种鉴定上有重要的参考价值，但除少数菌种外，一般不作为鉴定的重要依据。F.菌落的边缘：有些菌落的边缘整齐，有些不整齐。G.菌落的高度和下沉现象：有些菌落下沉现象明显，如黄癣菌、絮状表皮癣菌等，更有甚者菌落有时为之裂开。H.渗出物：一些真菌如青霉、曲霉的菌落表面会出现液滴。I.变异：有些真菌的菌落日久或多次传代培养而发生变异，菌落顔色减退或消失，表面气生菌丝增多，如絮状表皮癣菌在2～3周后便发生变异。②显微镜检查：小培养可置普通显微镜下直接观察，而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查。

       五、组织病理学检查

       真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值，尤其对深部真菌病的诊断意义更大，如用特殊染色可提高阳性率。
真菌的组织病理反应与其他一些疾病的组织病理反应极其相似，往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到真菌病的诊断。而在这种情况下，标本已被固定，培养有时已不可能进行，组织病理切片就成了真菌感染的主要依据。所以临床上在送病理标本的同时，要尽可能考虑到真菌感染的可能，以便同时采集标本 送真菌实验室进行真菌学检查。

       真菌在组织内一般表现为：①孢子：酵母和双相型真菌在组织内表现为孢子。②菌丝：许多真菌在组织中只表现为菌丝。组织中发现无色分隔、分支的菌丝多为念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分支的菌丝为接合菌，多为毛霉、根霉、犁头霉等。粗大、少分支有隔的菌丝为蛙粪霉菌。棕色菌丝为暗色丝孢霉病，由暗色孢科真菌引 起。③菌丝和孢子，主要见于念珠菌感染。④颗粒：为组织内由菌丝形成的团块。⑤球囊或内孢囊：球囊内含有内孢子，为球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构。

       组织病理片中根据形态和染色能基本确定种名的真菌为：荚膜组织胞浆菌、杜波伊斯组织胞浆菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、链状芽生菌、粗球孢子菌、新生隐球菌和鼻孢子菌等。根据组织病理中真菌的形态能确定属而不能确定种的病为：放线菌病、奴卡菌病、无绿藻病、念珠菌病、曲霉病和不育大孢子菌病等。多个属的真菌 感染可引起相同的临床表现，在组织病理中真菌的形态无法区别的病有皮肤着生芽生菌病、暗色丝孢霉病、接合菌病、皮肤癣菌病和足菌肿等。足菌肿的颗粒若染色适当，很易确定为放线菌性或真菌性的，也能区别出细菌性颗粒。真菌性颗粒中的菌丝又分为无色或暗色两大类。各种病原菌基本上形成各自顔色、大小、形成和结构的颗粒，可以初步区别，但最后确定必须依靠真菌培养。

       六、血清学方法

       随着诊断技术的进展，以免疫学方法检测真菌病已成为可能，引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，传统的检测方法主要为血培养 和组织活检，但血培养历时太长，且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功，阳性率较低。而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限，真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查用于深部真菌感染的实验室检测，可取得很好的效果。目前常用的免疫诊断方法有：①特异性抗原的检测：A.乳胶凝集试验(LA)。B.酶联免疫试验(EIA)。C.荧光免疫测定法(FA)。②特异性抗体检测：由于受检者都为免疫低下患者，因其致阳性率低，故现已少用。

       七、分子生物学方法

       近年来随着分子生物学的发展，已有聚合酶链反应(PCR)扩增、分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、DNA指纹图谱、随机扩增DNA多态性(RAPD)等方法。用于深部真菌病的诊断和分型研究，形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法。从这些新技术对多种致病真菌鉴定的应用过程中发现，此类方法具有操作简便、省时省力、特异性、敏感性高的优点。特别是从分子水平对真菌从遗传进化角度阐明菌种间内在的分类学关系，真正达到人们追求已久的自然分类的目的。我们有理由相信，随着PCR及相关技术在临床的应用及更广泛深入的研究，将会对真菌感染的诊断和鉴定产生根本的影响。