复旦大学袁正宏研究员HCV研究最新突破性进展

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    同其他黄病毒家族一样，丙型肝炎病毒(HCV)基因组的复制发生在病毒介导的一个ER来源的膜结构中，但人们对这一膜结构的复制复合体的形成认识还非常不足。近日，来自复旦基础医学院的袁正宏研究员与化学系陆豪杰教授展开合作，对HCV的复制的分子机制进行深入研究，发现了宿主人含缬酪肽蛋白（VCP，一种AAA ATP酶）功能被HCV劫持来实现复制复合体的组装，相关研究成果在线发表在国际期刊《病毒学杂志》（Journal of Virology）上。

      HCV主要由血液/体液传播，据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50%~80%HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化，肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。HCV基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，Core、E1和E2蛋白。p7是一种离子通道，对其是否为结构蛋白还存在争议。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B，它们对病毒的生活周期非常重要，其中NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B组成复制酶，完成HCV基因组复制。

    自1989年发现HCV以来，体外培养系统的缺失成为HCV研究瓶颈问题。直到2005年日本科学家Wakita从一位病人体内分离出JFH1病毒株才成功构建了世界首个HCV全基因感染性分子克隆，为HCV研究打开了一个全新局面。今年的拉斯克临床医学奖授予了三位HCV研究人员：德国海德堡大学的Ralf Bartenschlager；美国洛克菲勒大学的Charles Rice以及加拿大生物制药公司Arbutus Biopharma的Michael Sofia。其中Bartenschlager和Rice是因为他们对解析HCV如何在肝脏细胞中进行复制的机制做出了贡献。而Sofia则是由于将这些基础研究发现实现临床转化，研发出获得FDA批准的药物：Sofosbuvir，这种药物已成功治愈了被丙肝病毒感染的80多万患者。尽管现在已有高效治疗药物，但是丙型肝炎发病机理仍未十分清楚，其中之一就是膜结构复制复合体的组装机制。

    为了回答这一问题，袁正宏研究员与化学系陆豪杰教授展开合作，对病毒复制酶进行亲和纯化，鉴定出与病毒复制酶结合的宿主分子，以期阐明膜结构复制复合体的组装分子机制。研究人员在不影响病毒复制的前提下，对病毒NS5A和NS5B分别接上HA和His标签，通过两步亲和纯化，经质谱鉴定出与复制酶相互作用的宿主蛋白。通过siRNA实验验证，研究人员找到了Sec16A, Shroom3, ANKFY1, UPF1 和VCP这5个新分子，能够影响病毒的复制，其中VCP作用最为显著。后续机制研究发现VCP的ATP酶活性是病毒复制所必须的，VCP在感染的细胞中与NS5A共定位。当VCP的ATP酶活性缺失时，导致NS5A在胞内的定位异常，而影响复制酶复合体的组装。

    这一研究结果说明了HCV在感染过程中通过劫持宿主的AAA ATP酶VCP来调控复制酶复合体的组装，扩展了人们对HCV的复制的深入理解。文章第一作者是易志刚副研究员和方彩云副教授。研究得到了复旦大学基金和国家重大基础研究等项目的资助。

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Affinity purification of the Hepatitis C virus replicase identifies Valosin-containing protein (VCP) AAA+ATPase as an active viral replication modulator

Zhigang Yi1#, Caiyun Fang2, Jingyi Zou1, Jun Xu1, Wuhui Song, Xiaoting Du1, Tingting Pan1, Haojie Lu2 and Zhenghong Yuan

ABSTRACT
Like almost all the positive-strand RNA viruses, Hepatitis C virus (HCV) induces host intracellular membrane modification to form the membrane-bound viral replication complex (RC), within which viral replicase amplify the viral RNA genome. Despite accumulated information about HCV co-opts host factors for viral replication, our knowledge of the molecular mechanisms of how viral proteins, hijack host factors for replicase assembly has only begun to emerge. Purification of the viral replicase and identification of the replicase associated host factors to dissect their roles in RC biogenesis will shed light on the molecular mechanisms of RC assembly. Sought to purify the viral replicase in the context of genuine viral replication, we developed a HCV subgenomic replicon system in which two different affinity tags were simultaneously in-frame inserted into the HCV NS5A and NS5B. After solubilizing the replicon cells, we purified the viral replicase by two-step-affinity purification and identified the associated host factors by mass spectrometry (MS). We identified Valosin-containing protein (VCP) AAA+ATPase as an active viral replication modulator and its ATPase Activity is required for viral replication. Transient replication assay indicated VCP is mainly involved in viral genome amplification. VCP associated with viral replicase and co-localized with viral RC marker. Further, In a HCV replicase formation surrogate system, abolishing VCP function resulted in aberrant distribution of HCV NS5A. We propose HCV may co-opt a host AAA+ATPase for its replicase assembly.

Importance
Almost all the positive-strand RNA viruses share a common replication strategy, in which viral proteins modify host membranes to from the membrane-associated viral replicase. Viruses hijack host factors to facilitate this energy unfavorable process. Understanding this fundamental process is hampered by the challenges to purify the replicase due to the technical difficulties. In this study, we developed a HCV subgenomic replicon system in which two different affinity tags were simultaneously in-frame inserted into two replicase components. Using this dual-affinity-tagged replicon system, we purified the viral replicase and identified Valosin-containing protein (VCP) AAA+ATPase as a pivotal viral replicase associated host factor that is required for viral genome replication. Abolishing VCP function resulted in aberrant viral protein distribution. We propose HCV hijack a host AAA+ATPase for its replicase assembly. Understanding the molecular mechanism of VCP regulates viral replicase assembly may lead to novel anti-viral strategies targeting the most conserved viral replication step.

http://jvi.asm.org/content/early/2016/08/18/JVI.01140-16.abstract

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袁正宏研究员

上海医科大学医学博士/国家杰出青年基金获得者/复旦大学基础医学院教授，副院长/复旦大学生物医学研究院副院长/IBS传染病与公共卫生研究中心PI

      简历：

1985年毕业于江苏南通医学院医疗系本科，

1988年获南通医学院微生物与免疫学硕士学位，

1993年获上海医科大学医学博士学位。

1995-1996年获欧共体居里奖学金在英国帝国理工学院圣玛丽医院进修丙型肝炎病毒分子生物学;

1999，2002年作为高级访问学者分别在美国Washington University (St Louis)及Rockefeller University进行HCV分子生物学及RNA-蛋白相互作用的研究工作。

2001年7月起任部医学分子病毒学教育部/卫生重点实验室主任;

2001年7月至2008年4月 任复旦大学上海医学院副院长;

2005年1月起兼任上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心副主任;

2006年7月起兼任生物医学研究院副院长;

2008年4月-2012年10月任上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心党委书记兼副主任;

2012年9月起任复旦大学上海医学院(大医口)副院长;

2013年9月起任中共复旦大学委员会常委、副书记兼纪委书记。

研究方向：

主要开展乙型肝炎病毒（HBV）与机体天然免疫相互作用的应用基础研究，试图了解宿主如何感知HBV感染、启动天然免疫反应进而控制HBV复制，以及HBV如何逃逸宿主天然免疫、不被宿主清除而在体内建立持续复制，在此基础上进一步开发基于逆转或激活机体天然免疫反应、清除HBV持续感染的新策略，为优化临床治疗方案、提高治疗效果、最终治愈慢性乙肝提供新思路和新手段。

*研究方向一：肝炎病毒基因复制与致病机理的研究

    主要研究内容: 病毒基因，病毒蛋白与细胞蛋白间的相互作用,包括丙型肝炎病毒非结构蛋白与细胞蛋白及病毒RNA的相互作用, 丙型肝炎病毒RNA基因组复制及翻译机制.

*研究方向二： 肝炎病毒与干扰素相互作用的研究

    主要研究内容： 干扰素抗病毒作用及肝炎病毒抗干扰素作用的分子机制，包括肝炎病毒与干扰素在细胞和机体内的相互作用及其调控， 在干扰素应答中关键的细胞蛋白及其抗病毒作用，宿主因素对干扰素疗效的影响等。

*研究方向三：抗病毒感染免疫机理的研究

    主要研究内容: 机体先天与获得性免疫和DNA免疫的分子机制及增强免疫效果的策略，包括CpG与TLR9的识别及作用机制等。